限制性內切酶在中國
從20世紀60年代末發現限制性內切酶以來（見《限制性內切酶的前世今生》），大家平時了解到的限制酶相關研究和產品基本都來自國外。那么，限制酶在中國的發展又有哪些鮮為人知的故事呢？
01 中國的限制酶相關研究
由于歷史原因，中國的現代分子生物學研究直到20世紀70年代才真正起步，落后國外近20年。欲先善其事，必先利其器，分子生物學研究需要眾多工具酶和試劑。當時國外已有NEB、Fermentas等公司供應分子生物學試劑，但對于當時的中國科研人員來說價格非常昂貴，購買也很困難。于是大家只能自己動手，豐衣足食，在簡陋艱苦的條件下，自行開始分離純化限制酶的探索。
1978年，也就是Arber、Nathans和Smith因發現限制酶而獲得諾貝爾生理學或醫學獎的同年，我國核酸生化領域的奠基人、中科院上海生化所王德寶研究員（1980年當選為中科院學部委員）帶領團隊，從流感嗜血桿菌的三個不同菌株中分離純化獲得了三種限制酶，分別命名為HinP1I、HinS1I、HinS2I。其中HinS1I、HinS2I是HhaI的同裂酶，而HinP1I是HhaI的異裂酶。相關成果于1980年發表在《中國科學》上（圖1），這是中國最早關于限制酶的研究報道，也是中國第一次自主鑒定獲得限制酶。
圖1 中國第一篇限制酶研究論文
短短兩三年內，中科院上海生化所李載平團隊（1996年當選為中國工程院院士）、中國醫學科學院基礎醫學研究所梁植權團隊（1980年當選為中科院學部委員）、中科院生物物理所陳受宜團隊、中科院上海細胞所匡達人團隊、中科院微生物研究所張靜娟、武漢大學病毒學系、中山大學羅進賢、軍事醫學科學院基礎醫學研究所谷志遠等，分別參照國外文獻或自主改良方法，先后提取純化了BglI、BglII、PstI、BamHI、EcoRI、HpaII、AluI、SalI等十幾種常用的限制酶，純度和性能均不亞于當時國外同類產品。這些先驅者的辛勤工作，為正在起步的中國分子生物學研究提供了寶貴而及時的工具。
值得一提的是，1982-1984年，時任中國醫學科學院基礎醫學研究所助理研究員的強伯勤（1991年當選為中科院學部委員）赴NEB做訪問學者。在此期間，他在NEB主持鑒定了首批八堿基高特異性限制酶SfiI和NotI（NotI目前仍是NEB銷量最大的限制酶之一），還發現了NlaIII，NlaIV，NslI等一系列新的限制酶。
此后又有不少中國學者零星地從事限制酶鑒定、分離和純化的研究，也鑒定出了少量國外未曾報道的限制酶，但均未形成商業化產品。僅有1994年復旦大學陳中孚等在NEB的資助下從脂肪嗜熱芽孢桿菌GR75中分離獲得限制酶BsrGI，并進入NEB產品目錄。
在從天然細菌中分離純化限制酶的基礎上，2000年，中國協和醫科大學劉金毅等報道了限制酶EcoRII的重組表達過程，產率和純度均高于國外文獻。這是國內首次重組表達限制酶。此后，又有一些科研院所和公司也陸續開展了限制酶重組表達、發酵、純化的研究，并形成了一批論文和專利，但主要是滿足自用需求，也未能形成體系化的產品。
除了限制酶的分離、表達、純化外，也有少數中國學者對限制酶的功能、機制進行了一些研究。早在1982年，中科院上海生化所陳常慶研究員團隊就對限制酶EcoRI的底物專一性進行了研究。20世紀八九十年代，武漢大學生物系鄒國林老師對限制酶的活性、結合機制、反應動力學都進行了較為系統的研究。近年來，也有一些國內研究者對限制酶的結構進行了一些探索，但均未形成較大影響力。
圖2 限制酶DraIII的N端和C端結構域相互作用
T181A突變破壞了T181和D55之間的氫鍵，大幅降低了DraIII的星號活性
02 限制酶的國產化
與限制酶相關研究相比，在限制酶的商業化道路上，中國則走得更加坎坷。
1985年，真正意義上的中國分子生物學試劑先驅——中外合資的華美生物工程公司在河南洛陽成立。為什么會落在河南，坊間還有一段八卦。據說美國著名試劑商Promega某創始人的父親曾于上世紀30年代在河南一帶傳教，有了一段情結。后來該創始人80年代初到河南替父還愿，與當地政府一拍即合，與洛陽肉聯廠（即后來的春都集團）、中信興業三家合資成立了華美生物。
華美生物成立僅三年，就能生產80余種生物試劑，其中12項填補國內空白，11項達到了80年代中期國際先進水平，1989年就能夠向美國出口分子生物學產品，成為當時國內唯一的、專業化、高水平的工具酶供應基地。此后華美生物又進軍體外診斷行業，陸續開發出甲肝、乙肝、丙肝、HIV等多種病毒的酶聯免疫檢測試劑盒，2003年還率先在國內研制出SARS病毒診斷試劑。20世紀90年代發表的不少中文論文里，都說限制酶購自華美生物；然而也有地方提到當時華美生物只能自產DNA聚合酶等分子試劑，限制酶產品是Promega進口分裝。具體如何，因年代久遠已不可考。
可惜進入21世紀后，由于股東變更和后續的一系列謎之操作，華美生物在2004年被提請破產。2009年被收購后，重新在洛陽成立華美生物工程有限公司，但傷筋動骨，早已不復當年之勇。無論如何，作為中國生物技術行業的“黃埔軍校”，華美生物值得在中國生物技術發展史上留下濃重的一筆。
圖4 當年的華美生物工程公司
在華美生物提請破產之后的十余年間，DNA聚合酶、連接酶、逆轉錄酶等分子生物學常用工具酶一一被中國企業攻克，實現了國產替代。但國內限制酶市場從Promega，到后來的NEB、Fermentas/ThermoFisher、Takara三分天下，還是難覓中國企業身影。
限制酶大規模生產為什么這么困難？主要有三個原因。第一，限制酶能夠切割基因組DNA，在工程細菌中重組表達會引起細胞毒性，需要耗費大量精力篩選保護菌株和發酵工藝；第二，限制酶品種眾多，單做幾種不能滿足市場需求，但不同限制酶之間氨基酸序列差異大，性質不同，工藝需要逐個攻克；第三，限制酶產品中不能有其他核酸酶殘留，對純化工藝要求很高。
2015年，一群“不知天高地厚”的年輕人決心要搬掉限制酶這座橫亙在中國生物技術發展之路上的大山。他們以中國古代神話《愚公移山》激勵自己，將團隊也稱為“愚公”，并將限制酶研發計劃定名為“王屋計劃”。2016年，愚公成功獲得了首批限制酶產品。
時至今日，愚公生物（含旗下百時美生物）已經推出72種限制酶產品，其中包含62種LightNing系列快切酶、3種GMP級別限制酶和2種切刻內切酶，覆蓋了90%以上的限制酶應用場景，2023年國內市場占有率位居第三。
以限制酶為基礎，愚公生物建立了國內領先的毒性蛋白研發平臺，將產品線進一步拓展到其他毒性蛋白工具酶。未來，愚公生物將繼續堅持“創造酶好生活（Best Enzyme for Better Life）”的愿景，繼承老一輩科學家的精神，不斷守正創新，為中國生物醫學行業提供更多優質、經濟、方便的工具酶產品，助推中國生物醫藥產業發展。
