干貨分享 | 你的RT-qPCR內(nèi)參選對了么？
眾所周知，在研究基因表達(dá)水平時，往往使用逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR（即RT-qPCR）對目標(biāo)基因進(jìn)行相對定量。這就需要設(shè)定在不同條件下表達(dá)量都相對恒定的基因作為內(nèi)參 (internal control gene或reference gene)。一般來說，大家習(xí)慣選擇一些常見的管家基因（house-keeping gene），如β-Actin (ACTB)、Actin-2 (ACT2)、GADPH、18S rRNA等。因為這些基因通常是維持細(xì)胞基本生命活動所必需的，所以人們認(rèn)為無論組織類型、發(fā)育階段、細(xì)胞周期狀態(tài)或外部信號如何，這些基因的表達(dá)量都相對穩(wěn)定，可以被用作內(nèi)參。
然而，事實真的是這樣么？
隨著研究的深入，研究者重新審視了以往認(rèn)為表達(dá)量“穩(wěn)定”的那些house-keeping gene基因，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)水平并不是一成不變的，而是會隨著物種差異、組織類型差異、發(fā)育階段而發(fā)生變化，尤其是在某些病理或?qū)嶒灄l件下變化尤為顯著。如果不加分析地直接選用此類基因作為內(nèi)參，會對實驗結(jié)果、數(shù)據(jù)分析帶來極大誤導(dǎo)。
下面讓我們來看幾個例子。
01 擬南芥
2013年，研究者通過RT-qPCR和Microarray兩種技術(shù)分析了擬南芥的12種內(nèi)參基因在鐵缺乏條件下的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)常使用的ACT2基因在不同條件下表達(dá)水平差別可以達(dá)到2倍，而3個不常用的基因SAND、YLS8和TIP41-like表達(dá)量反而相對穩(wěn)定（圖1）。
圖1 鐵缺乏條件下的基因相對表達(dá)量
02 小鼠
2022年，研究者使用5種不同算法，分析了小鼠骨骼肌中常用內(nèi)參基因的表達(dá)量穩(wěn)定性，并按表達(dá)穩(wěn)定性從高到低排序。結(jié)果表明，常用的GADPH和18S rRNA排名都相當(dāng)靠后，表達(dá)水平穩(wěn)定性較差（圖2）。
圖2 小鼠模型中參考基因表達(dá)水平穩(wěn)定性的綜合排序
03 人
2015年，有研究者綜述了人類不同癌種研究中使用的內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)不同癌種適用的內(nèi)參基因存在較大差異。例如乳腺癌適合使用PUM1、ACTB等內(nèi)參基因；而對于胃癌，則可使用B2M、18S rRNA等基因作為內(nèi)參。
既然任何實驗條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因幾乎不存在，那么實際工作中應(yīng)當(dāng)怎么選擇RT-qPCR的內(nèi)參基因呢？
? 查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫
檢索同樣物種、類似條件（疾病）是否已有內(nèi)參基因相關(guān)研究。
亦可參考國家生物信息中心建立的RT-qPCR內(nèi)參基因數(shù)據(jù)庫：https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/。
? 使用多個內(nèi)參基因
無論選擇哪個內(nèi)參基因，在不同條件下單個基因的表達(dá)水平始終存在一定差異，最好的策略是使用2個以上的內(nèi)參基因。對人肺癌基因表達(dá)水平的研究表明，聯(lián)合使用3-4個基因作為內(nèi)參可以大幅提升穩(wěn)定性（圖3）。
圖3 五種條件下人肺癌內(nèi)參基因/組合的表達(dá)穩(wěn)定性排名
? 使用軟件分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性
已有多種軟件用于分析內(nèi)參基因結(jié)果的分析，常用的分析工具有：
-
geNorm （https://genorm.cmgg.be/） -
NormFinder（https://www.moma.dk/software/normfinder） -
BestKeeper （https://www.genequantification.com/bestkeeper.html） -
RefFinder （http://blooge.cn/RefFinder/）
其中，geNorm和NormFinder下載安裝比較麻煩，已有好心網(wǎng)友二次開發(fā)的網(wǎng)頁版供使用：https://seqyuan.shinyapps.io/seqyuan_prosper/。
相關(guān)產(chǎn)品
愚公生物提供高質(zhì)量的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR產(chǎn)品，助力基因表達(dá)研究。
參考文獻(xiàn)：
1. Han et al. (2013)Biometals. 26:403–413
2. Ma et al. (2022) PeerJ. 10:e14221
3. Sharan et al (2015) Cell Oncol. 38:419-431
4. Gu et al (2023) Front Oncol.13:1178629
