在限制酶種類知多少（上）中，我們介紹了細菌的“限制-修飾”(R-M) 系統，限制酶的命名方式，Type I限制酶和Type II中幾個主要的亞類。這期我們來繼續了解其他的限制酶種類。

?Type IIA

Type IIA類限制酶識別非對稱 (asymmetric) 序列，并在識別序列內部或距離識別序列特定距離的位點切割。因此，很多識別非回文序列的Type IIS亞類限制酶，如BspQI (GCTCTTC(1/4))，同時也屬于Type IIA亞類。

?Type IIE

Type IIE是一類特殊的Type IIP亞類，單體蛋白在催化結構域之外，還包含一個變構效應結構域 (allosteric effector domains)，兩個單體再組成同源二聚體。與普通的Type IIP限制酶不同，Type IIE類限制酶需要同一條DNA底物上有兩個識別位點才能更有效行使功能，其中一個識別位點與催化結構域結合作為切割位點，另一個與變構結構域結合，作為激活位點增強酶的活性。這一類型的典型代表是EcoRII/PspGI (/CCWGG) 和NaeI (GCC/GGC)。

圖6 Type IIE限制酶的亞基組成和切割模式

?Type IIF

Type IIF同樣是一類需要結合兩個識別位點的限制酶。這類限制酶一般形成同源四聚體，四個亞基結合兩個識別位點，然后同時切開兩個位點上的四條 (four) DNA鏈（雙鏈DNA的每個區域包含兩條單鏈），例如SfiI (GGCCNNNN/NGGCC)。當然，有些Type IIF限制酶也屬于Type IIE類，兩個酶切位點中有一個可能也會產生變構效應。

圖7 Type IIF限制酶的亞基組成和切割模式

?Type IIH

?Type IIM

?Type IIT

圖8 Type IIT限制酶的亞基組成

Type III限制酶往往以同源二聚體的形式行使功能，其單體蛋白同時具有限制酶和甲基化酶兩個結構域，同時還需要Mg²⁺、ATP和SAM作為輔助因子。Type III限制酶識別位點是同一個DNA分子上的兩段反向的序列（大多數含有A），單個識別序列本身一般是非回文的，但兩個識別序列反向對稱。兩個識別位點之間的間隔序列無特異性，長度變化較大。Type III限制酶的切割位點在其中一個識別序列之外固定距離的位置，有時切割不完全，很少被用作工具酶。

圖9 Type III限制酶的幾種切割模式

(a) 跟蹤碰撞模型；(b) 滑動模型；(c) 一維擴散模型

但是，由于Type III限制酶的切割位點和識別位點之間的間隔（一般24~28 bp）超過Type IIS，因此一些特殊應用中也會使用Type III限制酶。例如EcoP15I (CAGCAG(25/27)) 就曾被用于基因表達系列分析 (Serial Analysis of Gene Expression,SAGE) 和亨廷頓舞蹈癥的致病基因（密碼子CAG出現異常重復）分析。

Type IV限制酶最初是在T4噬菌體與大腸桿菌的相互作用中被發現的。這類酶組成形式多樣，不同種類可以識別并切割m6A、m5C、hm5C等多種甲基化位點，但序列特異性較差。被人們熟知的是來自大腸桿菌的McrA、McrBC和Mrr。在某些工程菌株中，Type IV限制酶的編碼基因需要被突變或敲除，以免影響外源基因表達。

近年來，隨著表觀遺傳學飛速發展，研究者發現不同的Type IV限制酶可以區分不同的甲基化修飾形式，于是嘗試將Type IV限制酶用作表觀遺傳學研究，例如使用McrBC分析CpG二核苷酸的甲基化狀態。

結語

限制酶作為基因工程最早也是最基礎的工具酶，仍發揮著強大的生命力。伴隨著基因組學，尤其是宏基因組學的發展，仍不斷有新的限制酶被測序鑒定出來，不斷豐富著生物學家的武器庫。

愚公生物在限制酶領域探索多年，目前產品已經覆蓋了Type IIP（含Type IIE、Type IIF）、Type IIS、Type IIM、切刻內切酶等多個亞類。未來我們將繼續扎根細分領域，不斷推出新的限制酶產品，為中國生物醫學行業提供更多優質、經濟、使用方便的工具，助推中國生物醫藥產業發展。

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