干貨分享 | 你的RT-qPCR內參選對了么？
眾所周知，在研究基因表達水平時，往往使用逆轉錄-熒光定量PCR（即RT-qPCR）對目標基因進行相對定量。這就需要設定在不同條件下表達量都相對恒定的基因作為內參 (internal control gene或reference gene)。一般來說，大家習慣選擇一些常見的管家基因（house-keeping gene），如β-Actin (ACTB)、Actin-2 (ACT2)、GADPH、18S rRNA等。因為這些基因通常是維持細胞基本生命活動所必需的，所以人們認為無論組織類型、發育階段、細胞周期狀態或外部信號如何，這些基因的表達量都相對穩定，可以被用作內參。
然而，事實真的是這樣么？
隨著研究的深入，研究者重新審視了以往認為表達量“穩定”的那些house-keeping gene基因，發現這些基因的表達水平并不是一成不變的，而是會隨著物種差異、組織類型差異、發育階段而發生變化，尤其是在某些病理或實驗條件下變化尤為顯著。如果不加分析地直接選用此類基因作為內參，會對實驗結果、數據分析帶來極大誤導。
下面讓我們來看幾個例子。
01 擬南芥
2013年，研究者通過RT-qPCR和Microarray兩種技術分析了擬南芥的12種內參基因在鐵缺乏條件下的表達量，發現經常使用的ACT2基因在不同條件下表達水平差別可以達到2倍，而3個不常用的基因SAND、YLS8和TIP41-like表達量反而相對穩定（圖1）。
圖1 鐵缺乏條件下的基因相對表達量
02 小鼠
2022年，研究者使用5種不同算法，分析了小鼠骨骼肌中常用內參基因的表達量穩定性，并按表達穩定性從高到低排序。結果表明，常用的GADPH和18S rRNA排名都相當靠后，表達水平穩定性較差（圖2）。
圖2 小鼠模型中參考基因表達水平穩定性的綜合排序
03 人
2015年，有研究者綜述了人類不同癌種研究中使用的內參基因，發現不同癌種適用的內參基因存在較大差異。例如乳腺癌適合使用PUM1、ACTB等內參基因；而對于胃癌，則可使用B2M、18S rRNA等基因作為內參。
既然任何實驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在，那么實際工作中應當怎么選擇RT-qPCR的內參基因呢？
? 查閱文獻和數據庫
檢索同樣物種、類似條件（疾病）是否已有內參基因相關研究。
亦可參考國家生物信息中心建立的RT-qPCR內參基因數據庫：https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/。
? 使用多個內參基因
無論選擇哪個內參基因，在不同條件下單個基因的表達水平始終存在一定差異，最好的策略是使用2個以上的內參基因。對人肺癌基因表達水平的研究表明，聯合使用3-4個基因作為內參可以大幅提升穩定性（圖3）。
圖3 五種條件下人肺癌內參基因/組合的表達穩定性排名
? 使用軟件分析內參基因穩定性
已有多種軟件用于分析內參基因結果的分析，常用的分析工具有：
-
geNorm （https://genorm.cmgg.be/） -
NormFinder（https://www.moma.dk/software/normfinder） -
BestKeeper （https://www.genequantification.com/bestkeeper.html） -
RefFinder （http://blooge.cn/RefFinder/）
其中，geNorm和NormFinder下載安裝比較麻煩，已有好心網友二次開發的網頁版供使用：https://seqyuan.shinyapps.io/seqyuan_prosper/。
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參考文獻：
1. Han et al. (2013)Biometals. 26:403–413
2. Ma et al. (2022) PeerJ. 10:e14221
3. Sharan et al (2015) Cell Oncol. 38:419-431
4. Gu et al (2023) Front Oncol.13:1178629
