更精確的RNA分子剪刀來啦！
RNA內切酶MazF —— RNA研究的新工具
小伙伴們已經看我們發了好多關于限制性內切酶的推文，有人會問了，你們天天在DNA上切來切去，有沒有工具能夠切RNA呢？這次我們就來向大家推薦一款可以在特定位置切割RNA的RNA內切酶——MazF。
No.1 MazF
MazF是細菌Type II“毒素-抗毒素 (toxin-antitoxin, TA)”系統”（聽起來是不是跟“限制-修飾”系統很像呢）中的一種毒素蛋白 (toxin)；它還有個形影不離的伙伴叫MazE，是一種抗毒素蛋白 (antitoxin)。平時MazF與MazE緊密結合，毒性被抑制。當收到外界脅迫等信號刺激時，MazF基因應激過表達，或者MazE蛋白降解，失去抑制的MazF蛋白開始切割mRNA，從而干擾（interfere）下游的一系列基因表達，產生細胞程序性死亡、細胞休眠等效應，從而應對外界脅迫。
圖1 Type II毒素-抗毒素系統
MazF是一個蛋白大家族，很多細菌中都含有這個家族的成員。最常見的MazF來源于大腸桿菌，特異性識別單鏈RNA中的ACA序列，最主要的切割位點是↓ACA，有時也會受上下游序列影響而變成A↓CA。
MazF對DNA和雙鏈RNA都沒有活性，如果RNA內部形成了二級結構，那么配對區域內的ACA就不能被切割。此外，MazF對m6A甲基化敏感，甲基化的m6ACA也不能被MazF切割。
圖2 MazF切割底物特征
MazF有兩個性質與DNA限制酶存在顯著差別：第一，MazF水解RNA磷酸二酯鍵的反應不依賴Mg2+，相反還會受Mg2+等二價金屬離子抑制。第二，MazF切割RNA的磷酸二酯鍵之后，形成的兩個末端分別是2’, 3’-環磷酸和5’-OH，產物不能直接用RNA連接酶重新連接。
No.2 MazF的應用
1. 高分辨率m6A甲基化分析
傳統的高通量RNA m6A甲基化分析依賴于m6A抗體（如MeRIP-Seq），分辨率只能到100 – 200 nt，靈敏度、特異性、分辨率和樣品量都存在較大限制。利用MazF不能切割m6ACA的性質，中山大學駱觀正教授和以色列魏茨曼科學研究學院Schraga Schwartz教授在2019年分別獨立開發了非抗體依賴的m6A高通量分析技術，各自命名為m6A-REF-seq和MAZTER-Seq。
兩種技術采用相同的核心原理，都是用MazF來預處理mRNA，存在m6A修飾的ACA位點不會被切開，而沒有甲基化的同樣位點會被切開。然后將酶切后的片段建庫測序，與參考序列比較，切開和未切開的位置，測序分析獲得的豐度不一致，這樣就可以在全轉錄組水平上，以單堿基分辨率量化分析m6A甲基化水平。
圖3 MAZTER-Seq原理
此外，利用MazF和熒光定量PCR或基因芯片，也能夠量化分析特定位點的m6A甲基化水平。
圖4 m6A單堿基位點qPCR原理
2024年，復旦大學喬亮課題組又將MazF、滾環擴增 (RCA) 和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-TOF MS) 結合起來，開發了一種新的檢測m6A甲基化的方法。該方法可以在大量非甲基化RNA存在的情況下準確檢測低含量的甲基化RNA，且檢測限低，具有潛在的臨床應用前景。
圖5 MazF-RCA結合MALDI-TOF MS檢測m6A甲基化原理
2. mRNA藥物序列分析
與大多數生物藥物一樣，序列分析也是mRNA藥物的一個關鍵質量屬性。測序法雖然有效，但在生物制品的質量表征中，往往需要多種方法正交以獲取更全面準確的信息。高分辨率質譜作為測序法的正交方法，具有獨特的優勢：無需擴增直接分析核酸（避免測序過程中的錯配），更高的檢測靈敏度，更短的分析時間，可直接檢測修飾核苷酸等。
質譜分析mRNA序列的基本原理是，利用RNA酶將mRNA序列切割成短片段，然后用質譜分析每個片段的質量/電荷比，得到片段的精確分子量和二級碎片信息，從而獲得準確的短片段序列和量化信息，再用“拼圖”的策略將這些片段拼接起來得到完整mRNA的信息。
由于核酸僅有4個特定堿基，組合形式遠小于蛋白質，因此需要酶解成較長的片段，以獲得可以覆蓋完整序列的特征片段。僅用特異性切割單鏈RNA上鳥嘌呤 (G) 的RNase T1，片段往往不能覆蓋全序列。這時聯合使用特異性更高的MazF等其他RNA內切酶，就能獲得更好的mRNA mapping結果。
圖6 多酶聯合質譜分析mRNA序列原理
當然，與限制酶一樣，僅有識別一種序列的RNA內切酶還遠遠不能滿足需求。愚公生物將把RNA工具酶作為未來研發重點之一，為RNA工作者提供更多、更優質的工具。
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參考文獻：
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