酚/氯仿抽提DNA原理與步驟
- 一、酚/氯仿抽提原理與各試劑的作用
基本原理：有機(jī)溶劑會(huì)使雜質(zhì)蛋白變性，并將雜質(zhì)蛋白留在有機(jī)溶劑層，而DNA分子是有水溶性的，所以會(huì)進(jìn)入水溶液層，這樣DNA和雜質(zhì)蛋白就被分開了。
苯酚：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚。
異戊醇：在酚氯仿中加入少量異戊醇，可以減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。
- 二、酚/氯仿抽提DNA步驟
- 向樣品中加入等體積的DNA提取液（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1），顛倒充分混勻；
- 室溫16000×g離心5min，使水相和有機(jī)相充分分離，小心吸出上層水相并將該層轉(zhuǎn)移至新試管中。確保移液過程中不攜帶任何有機(jī)相；
- 向“2”的水相中加入1/10體積NaAc (3M, pH=5.2)，渦旋混勻；
- 加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇, 輕柔地顛倒混勻, 此時(shí)可以看到白色絮狀物, 置于 20℃冰箱中30min, 時(shí)間充裕時(shí)通常過夜冷凍析出；
- 13200 rpm, 5 min離心, 注意觀察有無白色沉淀, 吸走上清；
- 加入1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
- 于室溫下將開蓋的EP管的置于實(shí)驗(yàn)桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；
- 加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。
- 三、注意事項(xiàng)
- 苯酚-氯仿是除蛋白的，所以要充分震蕩混勻使蛋白變性，但又不能太劇烈而打斷DNA；
- 離心后要避免再次吸入有機(jī)相的苯酚-氯仿，盡量只取上清。如果吸取的上清中混雜了蛋白質(zhì)層和有機(jī)相，需要用DNA提取液再次抽提；
- 提取的DNA如果需要進(jìn)行測(cè)序，或避免離子干擾的實(shí)驗(yàn)，建議使用蒸餾水溶解DNA而非TE緩沖液。
